Въведение
Още от откриването на ДНК се развиха няколко технологии за генетично манипулиране на организмите за по-добри селскостопански и индустриални приложения. Следващото поколение техники за секвениране направиха идентифицирането на различните гени и мутации в ДНК по-лесно. ГМО и техниките за клониране, които се използват от доста време, са пряк резултат от напредъка в тази област. Тези техники за клониране са били използвани за широк спектър от медицински, селскостопански, индустриални и изследователски приложения през последните няколко десетилетия. Въпреки цялото развитие и напредък обаче има постоянна нужда от по-усъвършенствани техники за редактиране на гени, които са прецизни и точни. Използването на програмируеми нуклеази за генетични модификации се увеличи през последното десетилетие поради потенциала им за лечение на различни наследствени заболявания и рак. През последното десетилетие излязоха наяве три основни класа програмируеми нуклеази – нуклеазите с цинков пръст (ZFNs), ефекторни нуклеази, подобни на активатор на транскрипция (TALENs) и клъстерираните редовно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR), свързани с Cas9 (CRISPR/Cas9) .
Цинкови пръстови нуклеази (ZFNs)
ZFNs е най-ранният разработен инструмент за редактиране на геном с по-голяма прецизност за способността им да променят генетичното съдържание. ZFNs са изградени от два домена, повтарящи се цинкови пръстови протеини (ZFPs) с техните ДНК-свързващи домейни, слети с неспецифичния домен на ДНК разцепване на FokI рестрикционна ендонуклеаза. ZFN функционират като димер, където всяка мономерна единица има способността да разпознава девет до 18 базови двойки (bps) ДНК чрез ДНК-свързващия домейн на цинковия пръст. Има широка гама от домейни на цинков пръст, които разпознават отделните ДНК триплети. Те могат да бъдат обединени заедно, за да генерират полидактилови протеини с цинков пръст, които могат да се насочат към широк спектър от възможни ДНК последователности. Въпреки това редактирането/мутациите извън целта са основната грижа, свързана с редактирането на гени, базирано на ZFN. Следователно има достатъчно възможности за подобряване на ефективността на този процес.
Ефекторни нуклеази, подобни на активатор на транскрипция (TALENs)
TALEN се появи като алтернатива на ZFN за редактиране на генома. Подобно на ZFNs, TALENs съдържат два програмируеми ДНК-свързващи домена, слети към FokI ендонуклеазен домейн и работят чрез въвеждане на двойноверижни прекъсвания (DSBs). Ефекторите, подобни на активатор на транскрипция (TALEs), се секретират естествено от Xanthomonas spp. на бактерии, които се свързват с ДНК на организма гостоприемник. TALE ДНК свързващият домейн е множество повторения с 33-35 аминокиселини, където всяко повторение разпознава единичен нуклеотид. Специфичността в TALE ДНК свързващия домен се дължи на наличието на хипер променливи региони, присъстващи във всеки домен на 12 и 13 аминокиселинни позиции. Следователно специфичните за последователността TALEN могат да бъдат генерирани чрез модифициране на тези аминокиселинни остатъци в хипер променливи области и свързване на различните TALE повторения заедно.
Клъстерирани редовно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR), свързани с Cas9 (CRISPR/Cas9)
В допълнение към ZFNs и TALENs, CRISPR/Cas9 е друг бързо развиващ се инструмент за редактиране на гени. Това е естествено срещаща се бактериална система, която действа като компонент на бактериалния адаптивен имунитет. Той осигурява защита на бактериите от нахлуването на вируси и плазмиди чрез РНК-насочвано разцепване на ДНК от Cas протеин. Има три основни компонента на системата CRISPR/Cas9 – CRISPR РНК (crRNA), транс-активиращата crRNA (tracrRNA) и ензимът Cas9. crRNA се транскрибира от нахлуващата система и е известна като протоспейсърна последователност и хибридизира с tracrRNA, която задейства и действа като база за свързване на Cas9 нуклеаза към мястото на разцепване на ДНК. За разлика от системите ZFNs и TALENs, които разпознават специфичните последователности в дадена последователност на генома, използвайки различни протеини за разпознаване, системата CRISPR/Cas използва последователността на РНК, комплементарна на целевата геномна последователност. Предимството на РНК хибридизацията при сайт-специфично разцепване задейства използването на химерна „водеща“ РНК (gRNA) за геномно редактиране, което се създава чрез сливане заедно на crRNA и tracrRNA. gRNA съдържа 20 нуклеотидни водещи последователности, предназначени за свързване към специфични ДНК последователности. Следователно, gRNA и Cas9 са в състояние да сканират подходящото място и да се свържат с него за създаване на сайт-специфични двойни верижни прекъсвания (DSB). По този начин системата CRISPR/Cas9 предлага относително по-точна техника за редактиране на гени в сравнение с предишните техники и може да се използва за широк спектър от приложения.
Заключение
Досега е очевидно, че настоящите механизми за редактиране на гени са по-прецизни и притежават широк спектър на приложение, без да имат по-големи етични и физиологични последици. Следователно по-големите финансови предимства и непрекъснатите подобрения в тази област са неизбежни. Също така, рационалното изследване и развитие, правилните идентификации на целите и защитата на интелектуалната собственост са значително важни за разработването на следващо поколение терапевтици, биологични продукти и процеси.
